Вплив фенілгідразина і додецил-β,D-мальтозида на гіпертонічний кріогемоліз еритроцитів людини і коня.

Abstract

Пошкодження еритроцитів при швидкому охолодженні від 37 до 0ºС в гіпертонічних середовищах визначається як гіпертонічний кріогемоліз (ГК) [2]. ГК використовують у якості експериментальної моделі для вивчення пошкодження клітин при заморожуванні. На рівні модельного підходу зручно досліджувати, як безпосередньо структури клітини, що піддаються впливу стресових факторів так і здійснювати тестування захисних речовин. В якості захисної речовини був обраний додецил-β,D-мальтозид – представник амфіфільних сполук, які, як було показано у роботі [4], знижують рівень пошкодження еритроцитів в умовах постгіпертонічного шоку при використанні їх у мікромолярних концентраціях. Відомо, що стан цитоскелет-мембранного комплексу у значній мірі обумовлює характер відповіді клітини на стрес. Тому у роботі була використана модифікація цитоскелет-мембранного комплекса еритроцитів за допомогою фенілгидразину. Обробка еритроцитів людини фенілгидразином призводить до деградації мембранних білків і, в першу чергу, основного цитоскелетного білка спектрина [2], порушує його зв’язок з білком смуги 3 та сприяє формуванню додаткових зв’язків гемоглобіну та спектрину [1]. Метою роботи було вивчити вплив фенілгидразина на ГК еритроцитів людини та коня і на антигемолітичну активність додецил-β,D-мальтозида (ДМ). Для дослідження використовували еритроцити, отримані з консервованої крові людини (Нomо sapiens) і коня (Equus caballus), заготовленої на консерванті «Глюгіцир». Роботу з тваринами проводили відповідно до «Загальних принципів експериментів на тваринах» (V Національний конгрес з біоетики, Київ, 2016). Для дослідження ГК еритроцитів ссавців 50 мкл осаду еритроцитів переносили в 0,5 мл розчину NaCl (1,2 моль/л або 2,1 моль/л) на 10 хв при температурі 37°С, потім з цієї проби 50 мкл суспензії еритроцитів переносили в 1,0 мл розчину NaCl тієї ж тонічності, охолодженого до температури 0°С на 10 хв. Амфіфільні сполуки додавали у гіпертонічне середовище, що знаходилось при температурі 0°С, перед внесенням до нього клітин. Модифікацію цитоскелету еритроцитів фенілгидразином здійснювали шляхом інкубування клітин з розчином фенілгидразину (1ммоль/л) при температурі 37°С протягом 10 хв. Вміст гемоглобіну, що вийшов у супернатант визначали спектрофотометричним методом за допомогою СФ-4А з проточною кюветою при довжині хвилі 543 нм. Встановлено, що рівень гемолізу еритроцитів людини і коня в умовах гіпертонічного кріогемолізу у середовищі 1,2 моль/л NaCl становить 80-90%, при збільшенні тонічності середовища до 2,1 моль/л NaCl – близько 40%. Попередня обробка еритроцитів людини і коня фенілгидразином зменшує чутливість даних клітин до ГК у 1,2 моль/л NaCl. При цьому зниження рівня гемолізу еритроцитів становить біля 20%. При ГК в середовищі, що містить 2,1 моль/л NaCl, рівень гемолізу модифікованих клітин не змінюється. Використання амфіфільної речовини додецил-β,D-мальтозида в умовах ГК в 1,2 моль/л NaCl показало, що ДМ проявляє антигемолітичну активність для еритроцитів коня (23%±2), але не має її у відношенні еритроцитів людини. При збільшенні тонічності середовища інкубації до 2,1 моль/л NaCl антигемолітична активність ДМ не змінюється (21%±5). При сумісному використанні фенілгідразина і додецил-β,D-мальтозида в умовах ГК у середовищі, що містить 1,2 моль/л NaCl, було встановлено, що модифікація еритроцитів фенілгидразином призводить до зниження ефективності ДМ. При цьому, антигемолітична активність ДМ для еритроцитів коня зменшується приблизно в 2 рази. У середовищі, що містить 2,1 моль/л NaCl, антигемолітична активність ДМ після модифікації клітин фенілгидразином не змінюється. Таким чином, модифікація цитоскелет-мембранного комплексу еритроцитів людини і коня фенілгидразином здатна підвищити стійкість цих клітин до дії гіпертонічних середовищ та низької температури, що свідчить про значну частку відповідальності білкової частини мембрани у розвитку пошкодження в умовах гіпертонічного кріогемолізу. Використання речовини амфіфільної природи, що здатна вбудовуватися у ліпідний бішар мембрани та змінювати його упорядкованість, дозволяє знизити чутливість еритроцитів в стресових умовах. Однак, сумісна дія фенілгідразина і додецил-β,D-мальтозида призводить до збільшення чутливості еритроцитів, що, ймовірно, обумовлено значними структурно-функціональними змінами цитоскелету та мембрани під дією даних речовин.