Температура та виснаження за АТФ як фактори впливу на постгіпертонічний гемоліз еритроцитів кролика

Abstract

Внутрішньоклітинний АТФ відіграє важливу роль у структурі та функціях мембрани еритроцитів. Вміст АТФ визначає ступінь фосфорилювання мембранних білків і ліпідів. Фосфорилювання та дефосфорилювання білків цитоскелету в мембрані еритроцитів опосередковують взаємодію бішар-цитоскелет, яка відіграє важливу роль у стабільності та деформованості 166 мембрани. Постгіпертонічний гемоліз є моделлю пошкодження клітин при поверненні клітин в фізіологічні умови після кріоконсервування [4]. В рамках цієї моделі, змінюючи енергетичний стан клітин, температурні умови, можливо підбирати оптимальні умови для розморожування клітин, вивчати механізми пошкодження та захисту клітин. Для дослідження використовували еритроцити кролика. Роботу з тваринами проводили відповідно до «Загальних принципів експериментів на тваринах» (V Національний конгрес з біоетики, Київ, 2013). Після видалення плазми еритромасу двічі відмивали шляхом центрифугування при 1000 g протягом 3 хвилин у 10-кратному об’ємі фізіологічного розчину (NaCl 0,15 моль/л; Na-фосфатний буфер 0,01 моль/л, pH 7,4). Для виснаження клітин за АТФ еритроцити інкубували з 2-дезоксіглюкозою (10 ммоль/л) протягом 2 год при 37°С. Постгіпертонічний шок здійснювали перенесенням еритроцитів з 2,0 моль/л NaCl в 0,15 моль/л NaCl при 0, 10, 20, 30 та 37°С. Вміст гемоглобіну в супернатанті визначали спектрофотометрично. Статистичну обробку отриманих експериментальних результатів проводили за допомогою програми «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США). Рівень пошкодження контрольних клітин складав: за температури 0°C – 64±6%, 10°C – 47±5%, 20°C – 36±7%, 30°C – 38±6%, 37°C – 39±6%; клітин виснажених за АТФ – за температури 0°C – 53±6%, 10°C – 39±6%, 20°C – 31±6%, 30°C -32±6% - 37°C - 33±6%. Дані демонструють залежність постгіпертонічного пошкодження еритроцитів кролика як від температури, так і від виснаження клітин за АТФ. Так підвищення температури від 0°C до 37°C для контрольних клітин призводить до зменшення рівня гемолізу в 1,6 рази. Найбільш істотне зниження пошкодження спостерігається при підвищенні температури від 0°C до 10°C. Менш істотне – від 10°C до 20°C. Подальше підвищення температури не веде до зниження пошкодження клітин. Що стосується АТФ-виснажених еритроцитів вони показують менший рівень пошкодження ніж контрольні клітини. Зниження складає біля 20 відсотків і є приблизно однаковим у всьому досліджуваному температурному діапазоні. Відомо, що метаболічне виснаження еритроцитів призводить до сильнішої асоціації між спектрином і мембраною, оскільки виснаження за АТФ запобігає фосфорилюванню білка 4.1R, що сприяє зв'язуванню комплексу 4.1R-спектрин-актин. Внаслідок цього спостерігається збільшення модулю пружності, натягу та в’язкості мембрани, вона стає більш жорсткою та пружною [3]. Це може бути причиною деякого зниження пошкодження еритроцитів за умов постгіпертонічного шоку еритроцитів, оскільки механічна тривкість мембрани підвищується. Існування температурної залежності постгіпертонічного пошкодження демонструє залучення до процесу фосфоліпідної компоненти мембрани еритроцита. Так відомо, що температура модулює плинність мембран і, таким чином, поділ фаз та організацію ліпідних доменів [2]. У біологічних мембранах відсутні різки фазові переходи, порядок ліпідів змінюється лише лінійно з температурою. Латеральна організація мембран у живих клітинах проявляється 167 невеликими гетерогенними та високодинамічними доменами. При зміні температури змінюється склад та розмір цих доменів. При підвищенні температури у зовнішньому моношарі скорочується кількість доменів, збагачених сфінгомієліном та збільшується – збагачених фосфатидилхоліном [1]. Перерозподіл фосфоліпідів може впливати на плинність мембрани, здатність витримувати розтягнення та змінювати критичний гемолітичний об’єм. Це може слугувати поясненням зменшення пошкодження еритроцитів при підвищенні температури в умовах постгіпертонічного шоку. Отже, як умови навколишнього середовища, так і стан клітин на момент стресового впливу мають своє значення. В реальних умовах важко окремо відслідкувати всі процеси, для цього доцільно використовувати модельні експерименти, які здатні врахувати усі умови окремо та передбачити результати реального процесу. Так, за результатами досліджень впливу температури на постгіпертонічний гемоліз можна зробити висновок, що використання більш високої температури при переведенні клітини у фізіологічні умови зменшує відсоток пошкоджених клітин.