Значення енергетичного статусу еритроцитів у прояві ефективності хлорпромазину за стресових умов

Abstract

Вступ. АТФ є основним енергетичним джерелом в еритроцитах ссавців. Внутрішньоклітинний АТФ відіграє важливу роль у структурі та функціях мембрани еритроцитів. Вміст АТФ визначає ступінь фосфорилювання мембранних білків і ліпідів. Таке фосфорилювання модулює взаємодії бішару з цитоскелетом і впливає на стабільність мембрани. Зниження концентрації АТФ в еритроцитах супроводжується зміною динамічного стану ліпідного бішару, цитозольної білкової мережі, функціонування ряду ферментних і транспортних систем. Це може відбиватися на здатності еритроцитів протистояти стресовим навантаженням. В процесі розморожування еритроцитів після кріоконсервування, їх мембрана піддається надмірному осмотичному навантаженню в процесі повернення клітини в фізіологічні умови. Для вивчення цього процесу створена модель постгіпертонічного шоку. В рамках цієї моделі, змінюючи вихідний стан клітин, температурні і осмотичні умови, вводячи додаткові речовини, можливо підбирати оптимальні умови для розморожування клітин. Мета дослідження. Вивчити вплив хлорпромазину на рівень гемолізу контрольних та виснажених за АТФ еритроцитів кроля за умов постгіпертонічного шоку. Матеріали і методи. Для дослідження використовували еритроцити, отримані з крові кролика. Роботу з тваринами проводили відповідно до «Загальних принципів експериментів на тваринах» (V Національний конгрес з біоетики, Київ, 2013). Після видалення плазми еритромасу двічі відмивали шляхом центрифугування при 1000 g протягом 3 хвилин у 10-кратному об’ємі фізіологічного розчину (NaCl 0,15 моль/л; Na-фосфатний буфер 0,01 моль/л, pH 7,4). Виснаження клітин за АТФ проводили за наступним методом. Еритроцити інкубували з 2-дезоксіглюкозою (10 ммоль/л) протягом 2 год при 37°С, після чого відмивали фізіологічним розчином. Постгіпертонічний шок здійснювали перенесенням еритроцитів з 2,0 моль/л NaCl в 0,15 моль/л NaCl при 0°С та при 37°С. Вміст гемоглобіну в супернатанті визначали спектрофотометрично. Для всіх зразків проводили обчислення середнього арифметичного значення і значення середньоквадратичної помилки (M ± m). Статистичну обробку отриманих експериментальних результатів проводили за допомогою програми «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США). Результати та обговорення. Отримані результати показали незначне зниження чутливості еритроцитів, виснажених за АТФ, до постгіпертонічного шоку порівняно з контрольними клітинами. Так, рівень гемолізу контрольних клітин у обраних експериментальних умовах складає 64 ± 6% та 39 ± 4% при 0°С та 37°С відповідно. Виснажені за АТФ еритроцити демонструють менше пошкодження – 53 ± 5% та 33 ± 3% при 0°С та 37°С відповідно. Додавання амфіфільної сполуки на етапі регідратації контрольних клітин знижує рівень гемолітичного пошкодження при 0°С, але не при 37°С. Рівень постгіпертонічного гемолізу у присутності хлорпромазину для них складає 36 ± 5% при 0°С та 69 ± 7% при 37°С. Тобто, можна сказати, що хлорпромазин проявляє захисну дію щодо еритроцитів кроля в умовах постгіпертонічного шоку при 0 °С, та чинить додаткову пошкоджуючи дію при 37°С. Еритроцити, що виснажені за АТФ, поводять себе інакше. Рівень постгіпертонічного пошкодження виснажених за АТФ клітин в присутності хлорпромазину складає 51 ± 6% при 0°С та 76 ± 8% при 37°С. Тобто хлорпромазин не впливає на рівень постгіпертонічного гемолізу при 0°С та чинить додаткову пошкоджуючу дію при 37°С щодо клітин, виснажених за АТФ. Відомо, що метаболічне виснаження еритроцитів призводить до сильнішої асоціації між спектрином і мембраною, оскільки виснаження за АТФ запобігає фосфорилюванню білка 4.1R, що сприяє зв'язуванню комплексу 4.1R-спектрин-актин та збільшує пружність мембрани. Це може бути причиною деякого зниження пошкодження еритроцитів за умов постгіпертонічного шоку еритроцитів, оскільки механічна тривкість мембрани підвищується. Хлорпромазин є катіонною амфіфільною сполукою. Результати досліджень препарату підтверджують наявність домінуючих гідрофобних і значних додаткових електростатичних взаємодій при зв'язуванні хлорпромазину з мембраною. Ці дослідження демонструють переважну взаємодію між хлорпромазином і аніонними ліпідними компонентами, що розташовані у внутрішньому моношарі ліпідного бішару мембрани. Фосфатидилсерин – основний негативно заряджений ліпід у внутрішньому моношарі – має приблизно 60% негативного заряду ліпідів. Інші аніонні фосфоліпіди, такі як фосфатидилетаноламін, фосфатидилінозитол і поліфосфоінозитиди, є мінорними, але в сукупності вносять 40% чистого негативного заряду. Відомо, що при метаболічному виснаженні рівні поліфосфоінозитидів знижуються. Таким чином, невелика зміна молярних рівнів цих ліпідів може привести до достатніх змін аніонного заряду внутрішнього моношару ліпідного бішару. Це може знижувати зв’язування хлорпромазину з мембраною та слугувати поясненням відсутності захисної дії цієї амфіфільної речовини щодо клітин, виснажених за АТФ. Отримані дані узгоджуються з результатами дослідження щодо впливу тривалості зберігання крові на ефективність захисної дії амфіфільних речовин в умовах температурно-осмотичного стресу (дані не приведені). За результатами цього дослідження тривале гіпотермічне зберігання (більше 24 годин) призводить до зниження захисної дії хлорпромазину в умовах постгіпертонічного шоку еритроцитів, що може бути пов’язане з метаболічним виснаженням клітин. Висновки. Таким чином можна зробити висновок, що метаболічне виснаження еритроцитів змінює їх фізико-хімічні характеристики, що впливає на результативність протоколів захисту клітин у стресових умовах.