Кріоконсервування і низькотемпературне зберігання похідних плаценти та їх вплив на перебіг експериментальної гінекологічної патології

Abstract

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.35 – «криомедицина». Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2019. Диссертационная работа посвящена изучению влияния факторов низкотемпературного хранения на морфофункциональные характеристики производных плаценты и их биологического действия на репродуктивную систему в норме и при єкспериментальной гинекологической патологии. Применение криоконсервированных производных плаценты для клеточной и тканевой терапии гинекологической патологии обусловлена тропностью плаценты к структурам репродуктивной системы, низкой иммуногенностью, большим количеством материала, возможностью аутобанкинга. На первом этапе работы исследованы свойства естественных и искусственных производных плаценты (эксплантов, сфероидов, клеток в суспензии и альгинатных сферах). Клетки, экспланты и альгинатные микросферы обладали стабильными характеристиками, сфероиды были менее стойкими, адгезировали к пластику, легко разрушались при механическом воздействии. При субнормотермичних условиях при температуре 20ºС в среде культивирования возможно сохранение производных плаценты без значительной потери жизнеспособности в течение короткого времени, достаточного для транспортировки. Клетки, альгинатные микросферы и сфероиды хранятся 48 часов, экспланты 72 часа. При снижении температуры до гипотермический условий 4°С срок хранения снижается до 24 часов. Криоконсервирование при стандартных условиях с применением среды культивирования с 10% диметилсульфоксидом и двухэтапным режимом позволяет получить сохранность клеток и эксплантов на уровне более 90% по разным показателям, клеток в альнинатных сферах - около 70%, сфероидов - около 50%. Сохранность при криоконсервировании зависит от состава среды (преимущество имеют более близкие по составу к среде культивирования), типа и концентрации криопротекторов, колебаний температур в криохранилище (колебания более 100ºС снижают характеристики меньше, чем за 10 циклов), межклеточных связей и межклеточного вещества, из-за значительного специфического влияния на льдообразование (альгинат и прямые связи в сфероиде ухудшают сохранность, а межклеточное вещество в эксплантах улучшают). Создание нетоксичных криозащитных сред из разрешенных к клиническому использованию, целесообразно проводить на основе пропандиола, поливинилпирролидона на основе многокомпонентных кристаллоидных растворов (раствор Хэнкса, Рингера). При этом возможно снижение сохранности на 15-20% по сравнению с 10% диметилсульфоксидом. На втором этапе сопоставлено действие нативных и криоконсервированных производных плаценты на изолированные элементы женской половой системы и регуляторные элементы in vitro. Доказано однонаправленность действия нативных и криоконсервированных объектов. Выявлено стимулирующее влияние на органотипическую культуру матки, нейроклетки, наличие нейропротекторного эффекта. Угнетающий эффект наблюдался при воздействии на спленоциты и яичники. Констатировали отсутствие влияния на культуру фибробластов. Наблюдаемый эффект характерен как для плаценты во время беременности, так и для использования стволовых клеток. На третьем этапе определено, что криоконсервированные производные плаценты приводят к временной задержки овуляции, некоторой гипертрофии матки у интактных животных. При моделировании патологических процессов криоконсервированные производные плаценты улучшают течение аутоиммунной патологии (антифосфолипидный синдром), эндокринной (синдром поликистозных яичников), травмы и ишемии (перекрут яичников, операционная травма), синдрома истощения яичников вследствие химиотерапии. Однако применение криоконсервированных производных плаценты при острой инфекционной патологии (перитонит, сальпингоофорит) приводит к отягощению инфекционного процесса, повышенному спайкообразованию. На основе проведенного исследования можно рекомендовать при разработке тканеинженерных конструкций и криоконсервировании многоклеточных структур, тканей, органов учитывать характер межклеточных взаимодействий, возможное взаимодействие материала скафолда или межклеточного вещества со средой криоконсервирования. Криоконсервированные экспланты плаценты являются перспективными для применения в терапии гинекологической патологии аутоиммунного, эндокринного, токсического или травматического генеза, но противопоказаны при остром воспалительном процессе или повышенном риске спайкообразования.