Вплив фенілгідразину на антигемолітичну активність додецил-ß,D-мальтозида в умовах гіпертонічного стресу еритроцитів ссавців

Abstract

Гіпертонічний стрес (ГС) - це модель, за допомогою якої вивчають вплив одного з основних чинників ушкодження клітин при заморожуванні, а саме – висококонцентрованих розчинів солей, що утворюються в результаті кристалізації води. Стійкість клітин до дії ГС обумовлена станом цитоскелет-мембранного комплексу, саме тому використання модифікаторів цитоскелету і мембрани дозволяє вивчити реакцію еритроцитів до зміни осмотичних умов середовища. Використаний у роботі фенілгідразин призводить до деградації цитоскелет-мембранних білків, перш за все, спектрина (Arduini A. et al., 1989, Ijaz F. et al. 2017), а додецил-, D-мальтозид (клас неіонних амфіфільних сполук) має суттєвий модифікуючий вплив на клітинну мембрану (Hagerstrand H. et al., 1991, Шпакова Н.М., 2014). Об'єктами дослідження служили еритроцити людини, коня і бика. Для здійснення ГС клітини переносили в розчин, що містить 4,0 моль/л NaCl, на 5 хвилин при температурі 37 або 0 °С. Амфіфільну сполуку додавали в гіпертонічне середовище перед внесенням у нього клітин. Модифікацію цитоскелету еритроцитів здійснювали в умовах постійного перемішування в фізіологічному розчині (0,15 моль/л NaCl, 0,01 моль/л фосфатний буфер, pH 7,4), що містить фенілгідразин в концентрації 1 ммоль/л, при температурі 37°С протягом 10 хвилин. Кількість гемоглобіну, що вийшов в супернатант, визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 543 нм. За 100% приймали поглинання проби, в яку додавали детергент тритон Х-100 в концентрації 0,1 %. Показано, що в гіпертонічних умовах початковий рівень пошкодження еритроцитів досліджуваних видів ссавців значною мірою відрізняється. Так, рівень лізису еритроцитів людини в 4,0 моль/л NaCl при 37°С становить 90 %, клітин бика – 80 %, коня – 60 %. При зниженні температури середовища до 0°С стійкість еритроцитів людини, бика і коня до ГС істотно зростає: рівень лізису еритроцитів людини в 4,0 моль/л NaCl при 0С становить 57 %, клітин коня – 15 %, еритроцитів бика - 7 %. Це, ймовірно, обумовлено більш щільною упаковкою мембранних ліпідів при низькій температурі, в результаті чого процеси ініціації дефектів і подальшого їх розвитку в клітинній мембрані утруднені. Модифікація еритроцитів людини і бика фенілгідразином в умовах ГС при 37ºС призводить до зниження чутливості даних клітин до ГС, тоді як для клітин коня спостерігається протилежний ефект, що, ймовірно, пов'язано з відмінностями в білковому і фосфоліпідному складі досліджуваних еритроцитів (Florin-Christenses J. et al., 2001., Matei H. et al., 2000., Virtanen JA et al., 1998). Модифікація еритроцитів ссавців фенілгідразином в умовах ГС при температурі 0ºС призводить до підвищення рівня ушкодження еритроцитів всіх досліджуваних видів ссавців, що може бути пов'язано з односпрямованою дією на клітину низької температури і фенілгідразину, а саме, підвищенням щільності упаковки мембранних ліпідів, зниженням плинності мембрани, а також зміною стану цитоскелета (Білоус А.М. та ін., 1994, Ogiso T. et al., 1989, Ijaz F. et al. 2017). У даній роботі також використовували амфіфільну неіонну сполуку - додецил-β, D- мальтозід (ДМ). Були отримані концентраційні залежності гіпертонічного гемолізу еритроцитів ссавців у присутності ДМ і розрахована антигемолітична активність речовини в умовах ГС еритроцитів при температурі 37 і 0°С. Показано, що ДМ проявляє високу захисну дію в умовах ГС еритроцитів ссавців. Антигемолітична активність ДМ для клітин людини, коня і бика досягає 70 %. При 0°С антигемолітична активність ДМ істотно знижується для еритроцитів всіх досліджуваних видів ссавців. Винятком є клітини бика, для яких при 0°С початковий рівень гемолізу клітин дуже низький (близько 6%), отже, оцінити антигемолітичну активність ДМ для них не є можливим. Обробка клітин людини, коня і бика фенілгідразином призводить до зниження захисної дії ДМ в умовах ГС як при 37°С, так і при 0°С. Це, ймовірно, пов'язано з тим, що окислення мембранних білків фенілгідразином обмежує їх рухливість, що надає мембрані жорсткість. В таких умовах амфіфільним сполукам складніше вбудуватися і пертурбувати плазматичну мембрану. Таким чином, антигемолітична активність ДМ знижується як при низькій температурі, так і після модифікації еритроцитів ссавців фенілгідразином. В обох випадках зменшується плинність еритроцитарних мембран (Білоус А.М. та ін., 1994, Fukushima Y. et al., 1990), що, ймовірно, і призводить до зменшення здатності ДМ проявляти свою захисну дію за допомогою пертурбації структури мембрани.