Модуляція постгіпертонічного пошкодження еритроцитів людини

Abstract

На даний час відомо, що постгіпертонічний шок є переважною формою пошкодження еритроцитів при розморожуванні. Висока концентрація солі, що утворюється при заморожуванні, призводить до ушкодження клітин після подальшого нагрівання та розведення до ізотонічних умов внаслідок танення льоду. Сучасні уявлення про постгіпертонічний шок базуються на гіпотезі надлишкового накопичення іонів натрію у внутрішньоклітинному середовищі шляхом зв’язування його з білковими молекулами. При відтаюванні білки звільняють іони у відповідь на розведення цитоплазми, що спричиняє вхід у клітину надлишкової води, і може відбуватися лізис при перевищенні межі пружності мембрани [1]. Застосування амфіфільних речовин, що здатні впливати на такі характеристики, як площа поверхні, плинність та проникність мембрани [2–5] може привести до зменшення рівня лізису та збереження більшої кількості клітин. Метою роботи є вивчення впливу трифторперазину та децилсульфату натрію на постгіпертонічний шок еритроцитів людини. Для дослідження використовували еритроцити, отримані з донорської крові людини, заготовленої на гемоконсерванті «Глюгіцир» («Біофарма», Україна). Після видалення плазми еритромасу двічі відмивали шляхом центрифугування (центрифуга «ОПн-3У4.2», Киргизстан) при 1000 g протягом 3 хвилин у 10-кратному об’ємі фізіологічного розчину (NaCl 0,15 моль/л; Naфосфатний буфер 0,01 моль/л, pH 7,4). Постгіпертонічний шок здійснювали перенесенням еритроцитів з гіпертонічного розчину (етап дегідратації, 1,65 моль/л NaCl) в ізотонічний розчин (етап регідратації, 0,15 моль/л NaCl) при 0 та 37 °С. Децилсульфат натрію у концентрації 200-1400 моль/л, трифторперазин у концентрації 50-300 моль/л додавали у середовище регідратації. Вміст гемоглобіну в супернатанті визначали спектрофотометричним методом. Кількість іонів калію визначали за допомогою іонометру ЕВ-74 з використанням іоноселективного електрода Еліс-121К і електрода порівняння ЕВЛ-1М3.1. 134 134 Для всіх зразків проводили обчислення середнього арифметичного значення і значення середньоквадратичної помилки (M±m). Статистичну обробку отриманих експериментальних результатів проводили за допомогою програми «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США). З отриманих даних видно, що додавання амфіфільної речовини у середовище регідратації при 37°С або не впливає на рівень пошкодження еритроцитів ссавців, або призводить до збільшення показників гемолізу при застосуванні децилсульфату натрію у концентраціях більш ніж 800 мкмоль/л, трифторперазину – більш ніж 50 мкмоль/л. При 0°С проявляється захисний ефект амфіфільних сполук та спостерігається зниження рівня гемолізу у певному концентраційному діапазоні кожної з досліджуваних речовин. Так у випадку децилсульфату натрію максимальний захисний ефект спостерігається у діапазоні 200-600 мкмоль/л; у випадку трифторперазину – 100-200 мкмоль/л. Максимальне зниження рівня гемолізу складає 3,4 та 3,2 рази для децилсульфату натрію та трифторперазину, відповідно. Враховуючи загальну спроможність амфіфільних сполук неспецифічно впливати на регулювання функції іонних каналів [2] та їх здатність до формування тимчасових дефектів проникності [5], було цікаво дослідити вплив досліджуваних амфіфілів на втрату калію еритроцитами в розчинах дегідратації та регідратації. Отримані дані демонструють, що у середовищі, що містить 0,15 моль/л NaCl не спостерігається втрати іонів калію, як у відсутності, так і у присутності амфіфільних сполук при обох температурах у досліджуваному часовому діапазоні. У середовищі, що містить 1,65 моль/л NaCl втрата іонів калію складає у контрольних зразках 90±3% та 56±2%, у присутності децилсульфату натрію – 94±6% та 59%±5, у присутності трифторперазину – 90±8% та 58±5% при 37°С та 0°С, відповідно. Видно, що як трифторперазин, так і децилсульфат натрію не впливають на вихід калію з клітин людини та кролика в досліджуваних середовищах при 0 та при 37°С. Відомо, що залежно від використовуваних концентрацій амфіфільні сполуки проявляють як захисний, так і прогемолітичний ефект в ізосмотичних [6–9] або гіпоосмотичних умовах [5, 8]. Одним з можливих пояснень захисної дії амфіфільних сполук на клітини при концентраціях нижчих за критичну концентрацію міцелоутворювання є вплив амфіфільних сполук на іонні канали [2, 6] та утворювання тимчасових дефектів проникності [5, 8]. Передбачається, що амфіфіли при інтеркаляції в ліпідний бішар мембрани швидко викликають перебудови всередині бішару і що ці перебудови пов’язані зі зміною проникності мембрани. Швидкий відтік іонів зменшує різницю в осмотичному тиску між внутрішньою та зовнішньою частиною клітини, тим самим захищаючи клітини. Але наші дослідження показали відсутність впливу досліджуваних амфіфільних сполук на вихід калію з еритроцитів людини. Отже вплив амфіфілів на проникність мембрани еритроцитів для іонів калію в досліджуваних умовах не є причиною прояву захисного ефекту. З іншого боку відомо, що інтеркаляція амфіфілів у мембрани спричиняє зміну форми клітин, збільшує її об’єм, змінює організацію та розмір ліпідних рафтів [4, 6, 10, 12, 13]. Таким чином, можна припустити, що захисний ефект досліджуваних

сполук реалізується за рахунок вбудовування молекул амфіфілів в ліпідний бішар, збільшення площі поверхні та радіусу клітини і, як наслідок, збільшення критичного гемолітичного об’єму.